「珍藏版」特别推荐丨全景式展现细胞焦亡的研究历程
撰文丨tac.G
责编丨迦 溆
All that lives must die, Passing through nature to eternity
—— Hamlet, William Shakespeare
编者按
科学研究往往不是一帆风顺，而是充满曲折、螺旋上升的探索过程，这在细胞焦亡的研究中可窥见一二。在2015-2016年，邵峰、Dixit VM等课题组几乎同时鉴定到GSDMD是炎症Caspase的特异底物，是焦亡发生的最终效应蛋白，此时距离首次发现Caspase-1可引起细胞死亡已过去19年，而距离首次报道Caspase-1（ICE）已过去26年（与之相比，首次报道凋亡Caspase（Ced3，Cell.1993）和凋亡过程被基本解析只用了不到10年时间）。
当知道答案后，再去回顾这场近30年的发现之旅，我们能看到科学家针对炎症Caspase和细胞焦亡过程进行了不懈的探索，他们走过很多弯路，有过对死亡模式的错误认知，也曾因动物模型问题虚掩了真相。而真相在一次次求索和质疑中渐渐廓清。时至近日，我们已可以为炎症Caspase诱导细胞焦亡过程绘制一幅颇为清晰的画卷。本文将简单回顾该领域的重要研究，为大家展现这场激动人心的发现之旅。
2019年“未来科学大奖”（生命科学奖）以及2019年度“求是奖”都授予了北京生命科学研究所（NIBS）邵峰老师，表彰他发现人体细胞内对病原菌内毒素LPS炎症反应的受体和执行蛋白。然而这一发现到底有多么重要？为什么在国际上有重要影响力？在科学“范式”上有什么样的重要贡献？等等，诸如这些问题本文都会给您答案。全文共计约1万字，将全景式的展现细胞焦亡领域的波澜起伏的画卷，BioArt编辑部酝酿一年多的文稿终于问世了，借此机会，BioArt也特别致敬邵峰老师（邵峰当选德国科学院院士）。
图1 焦亡研究的关键节点
Caspase发现及定义
1989年，Kostura MJ和Black RA分别报道了一种可以活化pro-IL-1β的新型蛋白酶，将其命名为ICE（IL-1β-converting enzyme）【1,2】。ICE可以通过将pro-IL-1β的116位Asp和117位Ala进行水解，使其成为具有活性的IL-1β。随后ICE的结构和功能被进一步解析【3-7】：ICE含有N端CARD结构域，用于募集上游蛋白活化功能，p20和p10结构域执行蛋白酶活性。在受到上游活化后，p10可以经自身水解（Autoproteolysis）从ICE蛋白上水解下来，再募集到p20结构域形成活性的ICE蛋白酶，进一步活化IL-1β。
2002年诺贝尔生理或医学奖颁给给对“细胞程序性死亡”领域（主要是颁给开创线虫作为模式生物，然后利用这一模式生物研究了器官发育以及细胞程序性死亡等）有杰出贡献的三位科学家 Sydney Brenner, H. Robert Horvitz and John E. Sulston。图片引自诺贝尔奖官网：https://www.nobelprize.org/prizes/medicine/2002/summary/
随后，1993年，袁钧瑛（导师为2002年诺奖获得者Robert Horvitz ）等在Cell报道了线虫中一个类似的蛋白酶Ced-3，与ICE含有相似结构域，这也是首个被报道的凋亡相关的Caspase蛋白【8】。随后，与之相类似的其他同源蛋白酶才相继被逐一发现。
直至1996年，袁钧瑛等7名细胞生物学领域专家在Cell撰文【9】，正式将之前鉴定发现的ICE/CED-3蛋白酶家族成员命名为Caspase(CASP)，即含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶（Cys-Asp Specific Proteinase）：该类蛋白酶以Cys为活性中心，可以识别特定序列的Asp位点进行水解。自此，可以活化IL-1β的蛋白酶ICE才顺势获得了Caspase-1的新名号。Caspase家族蛋白酶后续也分为炎症Caspase（Caspase-1/4/5/11）和凋亡Caspase（Caspase-3/6/7，Caspase-2/8/9/10）【10】。
图2 Caspase的首次定义
而此后的几年间，凋亡Caspase的功能和凋亡信号通路被迅速解析【11】，细胞凋亡作为研究最为深入的细胞程序性死亡对细胞生物学影响深远。在2001年之前，当提及Caspase引起细胞死亡，研究人员只有凋亡一种答案。因此在很长时间以来，我们对炎症Caspase调控细胞死亡的理解一直难有概念上的突破。
When cells burst and die, their contents are released, causing inflammation. （图片引自：https://www.medicalnewstoday.com）
“凋亡”OR“焦亡”
在1992年，Sansonetti团队在Nature发文报道志贺氏杆菌Shigella flexneri可以在感染进入细胞后引起巨噬细胞死亡，电镜观察发现该型细胞死亡有“染色质固缩、胞膜出泡、胞质空泡化、内质网膨胀，仍保留细胞器结构”，对基因组进行电泳后发现其DNA片段化，因此将其认定为凋亡【12】。到1994年，该团队进一步解析发现巨噬细胞在S.flexneri感染“凋亡”（当时误认为是凋亡 ）后可以释出大量IL-1，而未见有IL-6和TNFα【13】，并认为该型“凋亡”是伴有炎性反应的死亡形式。
1996年，Chen, Y等在EMBO J报道该型细胞死亡中存在Caspase-1的活化，应用其抑制剂可抑制细胞死亡，这是首次报道Caspase-1可以引起细胞死亡【14】。后续其他课题组继续辅证了这一结果，并发现该型细胞死亡可见于多种感染或病理性损伤中【14-16】，但这些研究均用“凋亡”定义这种炎症性细胞死亡。
图3 早期对Caspase-1引起“焦亡”的相关研究
数据和证据的量变终将引导质变的思考。在2000年，Brennan和Cookson发现巨噬细胞在感染沙门菌Salmonella后发生的细胞死亡与传统的凋亡有明显差异【17】。该文认为：
1）由沙门菌引起的细胞死亡引起明显的DNA片段化，与凋亡出现的核固缩有不同，且该型死亡不伴有Caspase-3和PARP的活化；
2）该型死亡胞膜破坏，与凋亡后仍保持胞膜完整性有明显不同；
3）该型死亡依赖Caspase-1活性。
随后，Boise与Collins在Trends in Microbiology撰写评论【18,19】，总结认为过去近10年发现感染过程中Caspase-1引起的细胞死亡与传统的凋亡是不同的死亡模式。这种新型的细胞死亡更为迅速，细胞膜完整性被破坏，并伴有明显的炎症过程。此外，该型细胞死亡的仍可有DNA的片段化、染色质固缩和细胞骨架破坏，这是与凋亡难以区分的特征【20】。凋亡的命名取自希腊语，“apopto-”意为“falling off”。Boise与Collins同样采用了希腊语中“pyro-”（意为fire），用来代表细胞死亡中发生炎症进展的特征，结合-ptosis词根，组合而成命名为“Pyroptosis”，即焦亡。
炎症小体的定义及上游通路研究
在焦亡被正式认领为新的细胞死亡类型时，这套复杂的通路里唯一清晰的是Caspase-1在感染后可以活化IL-1β，并引起细胞死亡。而Caspase-1的上游和引起焦亡的下游机制均不清楚。在下一个十年内，炎症小体（Inflammasome）被正式定义并开始深入研究，才解析了Caspase-1上游的信号通路【21】。
2002年，Martinon等在Mol Cell首次提出了Inflammasome这个概念【22】，他们发现在细胞内和无细胞系统中均证实胞内受体NALP1（即NLRP1）与接头蛋白ASC和Caspase-1可以组成复合体，参与对IL-1β的活化。此后，关于Caspase-1活化的上游信号，即通过不同受体组成的经典炎症小体被相继发现。
炎症小体受体是一类可以在胞内识别病原（PAMPs）或损伤性（DAMPs）信号的受体，如NLRs受体：当前研究最核心的NLRs受体为NLRP3，于2004年报道于Immunity【23】，其可以受多种感染和损伤性刺激（ATP，Nigerincin，低钾等）经ASC活化Caspase-1功能，并在2018年由陈志坚课题组最终解析其活化的机制【24】；2009年，同期两篇Nature报道了IFI20X/IFI16家族成员AIM2可以识别胞内DNA病毒或者dsDNA，依赖ASC活化Caspase-1以激活炎症小体【25,26】。这一类炎症小体受体依赖于接头蛋白ASC：NLRP3和AIM2这一类受体中不含有CARD结构域，但含有PYD结构域，其可以通过与ASC蛋白的PYD结构域结合形成speck。ASC蛋白含有PYD和CARD结构域，在炎症小体受体活化后可以通过CARD活化Caspase-1。
此外，细胞内还存在一类可不依赖ASC的，含有CARD的NLRs受体。NLRC4在2001年命名为IPAF，其上游可以识别细菌Ⅲ型分泌系统（如鞭毛）【27】。NLRC4已含有CARD结构域，可不依赖于ASC直接结合活化Caspase-1。作为第一个被发现的炎症小体受体，NLRP1可在炭疽致死因子LF作用下发生活化，但其特殊的“功能性降解”的活化机制于近期才最终解析【28,29】（详见此前BioArt的报道：Science 背靠背| 破解NLRP1炎症小体的活化之谜，中国农业大学董娜研究组和邵峰研究组合作在EMBO J上也发表了类似的研究结论：EMBO J. 丨董娜/邵峰合作揭示炭疽致死毒素激活NLRP1B炎症小体的机制）。
图4 炎症小体部分成员及复合体组成
总结来看，这些炎症小体受体通过识别不同的感染和损伤性刺激在胞内形成炎性复合体。Caspase-1在这个复合体内活化，通过自身水解（Autoproteolysis）并形成异源二聚体，成为具有完整功能的蛋白酶（p20/p10），其继续对完成对IL-1β和IL-18的活化以及焦亡。
Caspase-11功能初探
在2011年，已在炎症小体领域建树颇多的Dixit VM团队在Nature报道鼠源Caspase-11可以激活非经典的炎症小体活化【30】。Caspase-11是人源Caspase-4在小鼠的同源蛋白。本研究指出，既往使用的Strain 129小鼠品系被视为Casp1敲除的模型应用于其功能研究，而实际因Casp1和Casp11基因在小鼠基因组位置极为接近，故这些品系的Casp1敲除实际上为Casp1/Casp11双敲除小鼠。这些既往研究未能清楚解析CASP1和CASP11功能的差异，而将二者的功能混为一谈，导致Caspase-11的功能一直被掩盖。该文已经发现，单独Caspase-11可以通过未知机制感受到胞内菌的感染，可以不依赖Caspase-1引起细胞焦亡。并且本文的体内数据发现Caspase-11在致死性炎症反应中较Caspase-1发挥更为重要的作用。
图5 Caspase-11引起焦亡的首次证据
2013年，Dixit VM团队继续在Science发文，证实革兰阴性菌可以在胞内利用LPS激活Caspase-11，该作用不依赖于传统的LPS胞外受体TLR4【31】，即还存在未知的LPS胞内受体参与其中。这是2011年Dixit VM团队工作的延续性研究，但其仍未能给出LPS如何激活Caspase-11的答案。
这两篇研究开始将Caspase-11推上研究热点，也是首次提出存在非经典的炎症小体信号通路。在炎症小体被广泛研究之后，这两篇文章的出现将研究者的视线投向了其他炎症Caspase。回顾这两篇里程碑一般的文章时，我们能欣喜的看到，研究人员在这个时间节点上已经拨开迷雾接近了真相，而解决下一个关键问题后，我们将真正寻找到细胞焦亡的奥秘。此时，Caspase-11如何感应胞内LPS信号仍然未知，Caspase-11如何引起焦亡发生和下游蛋白也是未知。而以此为始的后续四年里，关于焦亡下游通路的研究爆炸性的涌现，使这两个问题被迅速解析。
焦亡下游通路的最终解析
学术研究的突破继续呈现了量变到质变的过程。在近20年的探索中，关于炎症Caspase和细胞焦亡的研究已经积累了足够数量的论文，确证了炎症Caspase引起的焦亡是不同于凋亡的死亡形式，解析了炎症小体作为上游信号激活炎症Caspase的机制，并将Caspase-11推上了研究热点。
2014年，邵峰研究组在Nature以长文（Article）的形式报道了Caspase-4/5/11可以直接识别结合胞内菌产生的LPS，而不需要其他胞内受体（如NLRP3等），该作用可直接活化Caspase-11不经过Caspase-1的作用直接发生焦亡【32】，完美解析了Dixt VM在11年、13年的工作。
本文的核心发现颇为有趣，作者在制备体外纯化蛋白时发现，在原核E. coli细胞中纯化的Caspase-4/11蛋白较从昆虫细胞Sf21中纯化的蛋白在电泳分离具有更高的分子量，而将昆虫细胞纯化的Caspase-4/11蛋白经细菌裂解液或LPS处理后也可以在胶中呈现分子量上升。这一奇特现象最终引导出Caspase-4/11可以不经任何受体直接结合LPS这一结论，解决了前述两篇文章一直的困惑。
图6 原核与真核纯化的Caspase-11蛋白在电泳中存在大小差异
紧接着在2015年，邵峰和Dixit VM团队在Nature发表背靠背的两篇长文，以及韩家淮团队略晚在Cell reseach的文章（比Nature文章晚70天左右在线）均发现GSDMD分子是Caspase-4/11的下游分子【33-35】。Caspase-4/11可以直接识别切割gasdermin家族成员GSDMD，引发细胞焦亡，这也是继IL-1β/IL-18后发现的另一个炎症Caspase的关键底物。三篇文章分别使用不同的策略找到了GSDMD：
1）Dixit VM的文章直接使用了ENU处理后的随机突变小鼠来检测对LPS的敏感性，找到Pedigree IGL1351这一突变小鼠对LPS处理不敏感，从而靶向到GSDMD这个分子（让人窒息的工作量和研究经费…）；
2）邵峰组在细胞水平，利用永生化的Tlr4-/- iBMDM经CRISPR/Cas9进行了两万余基因的敲除，经LPS电转处理诱导焦亡，收集存活的单克隆细胞，即对LPS引起焦亡不敏感的细胞，通过测序gRNA找到GSDMD分子（此文章承袭上一篇Nature文章，研究手段丝丝入扣，当然也要感谢CRISPR的横空出世。）；
3）韩家淮组首先构建了稳转Flag-NLRP3的J774细胞，经炎症小体激活处理后经IP后的定量MS检测了NLRP3的相互作用蛋白和结合丰度，经分析后找到了9个活化后结合增加的蛋白，GSDMD位列其中，后续实验证实其参与炎症小体活化和细胞焦亡。
三个课题组分别用不同的思路和工作量找到了目标蛋白，人力物力的积累和革新技术的应用让研究人员更迅速的找到真相。
图7 GSDMD被认证为炎症Caspase底物参与焦亡
到2016年，GSDMD引起细胞焦亡的具体机制被进一步廓清，竞争也益激烈。2017年共有5个团队发表文章证实这一机制：邵峰/王大成合作组（Nature）、Lieberman（Nature）、Dixit VM（PNAS）、Sebastian Hiller（The EMBO Journal）和韩家淮组（Cell research）【36-40】。GSDMD自身的N端和C端结构处于自抑制状态，经炎症Caspase切割后可以产生GSDMD-N和GSDMD-C两个肽段。其中GSDMD-N可以结合膜脂质，破坏其完整性，使胞膜破裂引起焦亡。此外，其他gasdermin家族成员GSDMA3和GSDMA也具有类似的功能。这些工作证实焦亡的最终效应蛋白为gasdermin家族成员，将这持续近30年的问题找到了答案。
图8 炎症小体及焦亡通路
邵峰组没有停止对焦亡的进一步探索，并用新的工作发现Caspase-3也可以引起细胞焦亡，将早早形成的“炎症Caspase引起焦亡”的观念打破（过去的主流观点认为Caspase3是凋亡Caspase）。邵峰老师在2017年在Nature继续发文发现Caspase-3可以识别水解gasdermin家族另一成员GSDME分子【41】。该分子在Caspase-3水解后可以以类似GSDMD的模式执行细胞焦亡过程。值得一提的是，在邵峰课题组发文之前，已有一篇NC率先发现了这一机制【42】。但遗憾的是，该文仍没有实现概念上的突变，认为这一种经Caspase-3发生的细胞死亡是“secondary necrosis”过程，且没有在内源蛋白中验证GSDME的功能，错失对其关键应用价值的探析（详见此前BioArt的特别报道：【BioArt专访邵峰院士】详解细胞焦亡新机制丨特别报道）。
邵峰组的发现向我们指出，细胞的死亡形式并不完全是由凋亡和炎症两类Caspase决定，而是由其识别水解的底物决定。当细胞内含有较高的GSDME蛋白时，因焦亡发生更为迅速，Caspase-3活化后可以先发生焦亡过程。而GSDME低表达或缺失的细胞中，Caspase-3仍通过活化Apaf-1发生凋亡。此外，邵峰组还发现正常细胞中GSDME表达要高于常规的肿瘤细胞，而机体在接受化疗后正常细胞可存在Caspase-3的活化从而影响正常细胞的存活。这提示GSDME可以作为新靶点，以减少接受化疗病人的正常组织损伤。
2018年，两个独立的研究团队分别在Science和PNAS上报道鼠疫耶尔森氏菌Yersina可以通过Caspase-8水解GSDMD引起焦亡（详见此前BioArt的报道：重点推荐！Science+PNAS更新认识，赋予Caspase-8参与细胞焦亡过程的新功能——邵峰点评）【43,44】。在Yersina感染中，毒力蛋白YopJ通过抑制TAK1（TGFβ-activated kinase）活性活化了RIP1和Caspase-8，对GSDMD执行水解引起焦亡，而Caspase-1/11均不参与该型焦亡的起始过程。在解析了一条新的焦亡通路之余，这两篇研究也继续佐证了邵峰课题组对焦亡研究的新论断：细胞死亡类型不由哪一种Caspase决定，而是Caspase的哪一种底物决定。
自此，“焦亡”这一细胞死亡的概念已经与其发现定义之初发生了太多变化。NCCD（The Nomenclature Committee on Cell Death）每隔几年会在Cell Death & Differentiation杂志根据进展更新细胞死亡的概念。在2009年和2012年的NCCD中，“焦亡”的定义被认为是由Caspase-1活化引起的炎症性细胞死亡【45,46】。而在2018年中，NCCD将其修正为：一种依赖于gasdermin家族蛋白形成质膜膜孔的可调控的细胞死亡（Regulated cell death），经常但并不总因炎症性Caspase的活化而完成【47】。自2000年焦亡概念被提出后，它的定义已脱离了最初发现的上游蛋白Caspase-1，而是由其效应蛋白gasdermin决定。
细胞不同的死亡方式。图片引自：Cell Death & Differentiation，2018
细胞焦亡下游事件的解析也极大地增加了焦亡的可控性。哈佛大学吴皓课题组顺利解析了Gasdermin A3引起细胞焦亡的膜孔复合体的结构【48】，为寻找可控靶点提供了结构支持。目前，GSDMD特异的小分子抑制剂NSA（necrosulfonamide）也已被找到【49】，其可特异靶向GSDMD-Cys191，抑制其寡聚体形成。尽管焦亡的发生有如“燎原之势”难以控制，Petr Broz课题组仍发现细胞内存在对抗焦亡的膜修复分子机器，即通过ESCRT系统（endosomal sorting complexes required for transport，转运必需内体分选复合物）在GSDMD-N产生的膜孔处收缩破损质膜，完成修复【50】。
随着细胞焦亡分子机制的解析及其下游事件逐步引起更多同行的关注，近两年国内外相关的研究工作逐步增多，围绕细胞焦亡“挖矿”成了最近这一段时期的时风。例如，中南大学吕奔团队阐明了脓毒症中Caspase-11通过活化其底物GSDMD来诱导弥散性血管内凝血的形成，揭示了免疫与凝血的内在联系；南京医科大学免疫学系的杨硕教授团队等揭示了炎症小体下游焦亡效应分子GSDMD通过调节cGAS介导的炎症反应来控制结肠炎发生的新机制以及报道了细胞焦亡效应蛋白在多发性硬化症中的致病机制；2020年年初，中国医学科学院基础医学研究所的黄波教授团队研究展示了CAR-T细胞激活靶细胞Capase-3并活化gasdermin E GSDME诱导癌症靶细胞发生细胞焦亡；进而同时释出ATP、HMGB1等因子，这些因子激活巨噬细胞内的caspase-1-GSDMD和MAPK-NF B炎症通路，进而引起炎症因子风暴。
这项研究为解决CAR-T疗法的副作用提供了潜在的方法，为优化设计新一代更加安全高效的治疗癌症的CAR-T提供思路。2020年5月4日，中科院上海巴斯德研究所的刘星研究员与美国哈佛大学医学院Judy Lieberman教授及吴皓教授合作报道了通过高通量筛选发现靶向GSDMD的小分子抑制剂——双硫仑，并揭示该小分子化合物对GSDMD成孔作用的抑制机理；2020年围绕细胞焦亡最为重要的工作要属前不久，两篇背靠背发表在Nature上的文章，揭示了细胞焦亡在肿瘤免疫方面的全新功能；另外，对于细胞焦亡领域来说，还有一项更新认识的重要发现是，2020年4月17日，邵峰课题组在Science发表文章，发现细胞毒性淋巴细胞中的丝氨酸蛋白酶Granzyme A可以经穿孔素进入靶细胞，通过水解Gasdermin B分子Lys229/Lys244位点诱导靶细胞发生焦亡，
值得一提的是在这篇Science文章发表之前不久的Judy Lieberman组的张志斌博士那篇Nature论文里面也发现了类似的结论，聚焦的是另一个丝氨酸蛋白酶Granzyme B，验证了Granzyme B对GSDME 的切割以及由此诱导的依赖于GSDME 的细胞焦亡，共同改写了焦亡只能经Caspase活化的定论。值得一提的是，今年年初，中科院生物物理所丁璟珒课题组和邵峰组合作在Cell上发表题文章，从结构学角度发现了caspase-1/4/11-GSDMD复合物形成中的关键特点。
2019年，邵峰等应邀为Nature Reviews Immunology撰写Gasdermin专题综述
在细胞焦亡这场发现之旅里，几代科研人员竭心尽力，终于将焦亡这一细胞死亡类型解析清楚，重要的是该领域蕴藏了巨大的转化前景，或许细胞因子风暴、肿瘤免疫、CAR-T疗法的一系列问题有望从细胞焦亡的角度逐步得到一些解决。
在这漫长的历程里，观念和技术是影响科学发现极为关键的因素。错误或片面的观念会阻碍对真相的认识和继续探索；而新检测方法的出现帮助重新定义概念，新技术的应用助力迅速锁定研究核心。
在阅读10年前、20年前那些里程碑似的论文时，我们看到前行者不懈的向科学难题发起冲锋，在解决旧问题之时又产生新问题，而这种反复螺旋式的求索照亮了生命科学研究中的诸多黑暗。如今再审视我们现有的答案，那些我们已经接受的观念里，还有多少真相被虚掩着，那些已知的复杂机制和通路里，还有多少问号潜藏着难以想象的真相。我们期待着新的答案和新的问题。
最后，BioArt特别致敬细胞焦亡领域最亮的那颗星 ——邵峰。