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今天跟大家分享的是2020年4月发表在Nat.Commun.（IF：11.878）杂志上的一篇文章Genomic programming of IRF4-expressing human Langerhans cells.在文章中作者对分离出的朗格汉斯细胞（LC）进行scRNA-seq、FACS和ChIP-seq在染色质和转录组水平进行了分析。其后运用CRISPR-Cas9基因编辑技术敲除IRF4，探究转录因子IRF4调控LC转录的潜在功能通路。
Genomic programming of IRF4-expressing human Langerhans cells
表达IRF4人朗格汉斯细胞的基因组编程
复现数据来源：GSE120386
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE120386
一.研究背景
LC作为免疫系统前哨位于表皮中，是抗原呈递细胞，也有激活皮肤记忆T调节细胞的免疫作用。阐明LC中的调节通路和机制非常重要，这些调节通路和机制能够促进表皮中的致耐受性和免疫应答。
二.分析流程
三.结果解读
1.分析人表皮LC及其功能
图1a：原代LC分离的图示。
从表皮中分离稳态LC，和在细胞培养基中迁移48 h，并用TNF刺激（24 h）以诱导LCs活化。图1b：对稳态和迁移LCs用流式细胞仪评估。
迁移LCs的高HLA-DR/CD207/CD1a细胞占比显著升高。图1c：接着对高HLA-DR/CD207/CD1a细胞表面的共刺激分子CD70、CD86、CD40作评估。
图1d：对照实验结果发现，迁移LCs的IFN-γ的分泌量显著增大（尤其是在EBV刺激下）。
图1e：TNF刺激下，迁移LCs的IFN-γ的分泌量也显著增大。
图1.用于分析LC和控制抗原交叉提呈的系统
2.LCs RNA测序分析转录组
作者对LCs的RNA进行测序来分析转录组。
图2a：在迁移LCs中主要功能通路的基因富集情况。
“抗原加工和呈递”显著富集。图2b：将LCs显著表达基因和抗原呈递、抗原交叉呈递基因取交集。
图2c：流式细胞仪评估。
迁移LCs诱导了SQSTM1和TRIM21蛋白（参与抗原加工的关键成分）的高表达。图2d：评估LCs在TNF刺激下，其中与抗原运输（红色）、抗原加工（淡紫色）、抗原交叉展示（蓝色）相关的基因的表达情况。
图2e：在TNF刺激的过程中，上调免疫激活基因的富集情况。（左图为早期诱导的基因；右侧图为晚期诱导的基因）
早期UBC、CD83、CD40被诱导高表达；晚期SQSTM1、PSME2被诱导高表达。
图2.迁移LCs的转录组分析
3.LCs中新陈代谢和抗原呈递的耦合
图3a.scRNA-seq分析迁移LCs（CD1a+HLA-DR+）的转录组。
聚类分为了5个簇。图3b.对簇1–3中细胞的伪轨迹分析表明，其成熟进程为：簇3→簇1→簇2。
图3c.对簇1–3通过GO分析作了功能注释。
图3d.进一步对簇1–3的抗原呈递、抗原加工、氧化磷酸化等基因进行富集分析。
簇1和簇2中细胞表达参与氧化磷酸化过程的基因的比例更高。
图3.迁移LCs的scRNA-seq分析
4.LC启动子中IRF（干扰素调节因子）结合元件的富集
为了确定涉及LCs基因组编程的转录因子，作者作了ChiP-seq和TF motif 富集分析。
图4a：用TNF刺激后，对簇3（早期，a图左侧条形图）和簇2（a图右侧条形图）上调的共表达基因簇中，计算在2 h时带有H3K27Ac（乙酰化）标记的DEGs的比例。
在LCs中观察到高水平H3K27乙酰化作用（90％和92％）。图4b：利用UCSC跟踪迁移LCs中H3K27Ac标记随TNF刺激的时间变化。
红色矩形表示代表性的启动子位点。图4c：进行TF motif 富集分析，来预测相关的转录因子。
在迁移LCs中，TF motif EICE（ETS-interferon composite element）显著富集；其次是AICE （AP-1-interferon composite element）、ISRE（interferon-stimulated response element ）。图4d：接着作了GO分析对带有H3K4Me3和H3K27Ac标记基因的启动子作了功能注释。
主要富集在“参与泛素化”、“抗原呈递”。
图4.迁移LCs的H3K4me3和H3K27Ac的染色质分析和TF motif 富集分析
5.LC的迁移和成熟与IRF4相关
图5A：FACS分析发现IRF4蛋白表达上调。
图5B：迁移LCs中IRF4+CD207+CD1a+细胞比例显著升高。
图5C：TNF刺激前后（2 h，24 h），迁移的LC中关键转录因子的转录水平。
JUN、SPI1和IRF4在LC中表达水平最高。图5D：TNF刺激前后的FACS分析结果表明：TNF刺激下，BATF3蛋白的表达基本保持不变，而IRF4的表达下调。
图5.LC在迁移时上调IRF4的表达
6.IRF4介导的LC的转录编程
作者使用CRISPR-Cas9编辑技术敲除LC中IRF4，进行下一步的分析。
图6a：对敲除组（KD）和野生型对照组（WT）作FACS分析，测量在CD207+CD1a+LC中IRF4的表达水平。
图6b：定量LC中IRF4的表达水平。
敲除组LC中IRF4的表达下调。图6c：对KD和WT组的LCs作了scRNA-seq分析，然后在UMAP图中分离了KD和对照组细胞的转录组。
图6d：对KD和WT组作GO分析。
两组在功能注释上存在显著差异。图6e：在WT组LC中以较高水平表达的基因的条形图。
图6f：在KD组LC中以较高水平表达的基因的条形图。
图6.IRF4介导的LC的转录编程
小结
作者对分离出LC进行scRNA-seq、FACS和ChIP-seq在染色质和转录组水平进行了分析。对迁移LC作snRNA-seq分析，降维聚类了三个主要亚群：簇1、2、3。另通过伪轨迹分析其成熟进程为：簇3→簇1→簇2。用ChIP-seq研究转录因子结合位点和组蛋白特异性修饰位点：H3K4Me3和H3K27Ac。通过FACS发现迁移LC中IRF4的高表达；且在TNF刺激下，IRF4表达下调。其后运用CRISPR-Cas9基因编辑技术敲除IRF4、通过GO分析功能注释等，探究了转录因子IRF4调控LC转录的潜在功能通路。