Western Blot（WB）

Western Blot( 蛋白印迹法)是一种将高分辨率凝胶电泳和免疫化学分析技术相结合的杂交技术，具有分析容量大、敏感度高、特异性强等优点，是检测蛋白质特性、表达与分布的一种最常用方法，已广泛应用于基因在蛋白水平的表达研究、抗体活性检测和疾病早期诊断等多个方面。

普健生物整合公司细胞实验、蛋白表达、分子生物合成实验平台提供专业的蛋白检测服务-Western Blot( 蛋白印迹法)。

服务流程：

1、处理获取待测蛋白样品。

2、初步定量检测。

3、凝胶电泳。

4、转模曝光。

5、结果整理。

6、提交报告。

服务优势：

1、保证实验的精确度，严格的QC质控。

2、对每一个结果用实验来论证给出解释。

3、全面的技术服务，完整的技术服务报告。

做好（Western Blot，WB）实验，了解掌握原理是关键，接下来请跟我一起来了解一下WB检测的原理，流程和它的应用。

Western Blot原理：抗原与抗体反应

Western Blot利用SDS-PAGE技术将生物样品中的蛋白质分子按分子量的大小在凝胶上分离开，然后用电转移的方法将蛋白转移到固相膜上，以固相膜上的蛋白质作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶标记的第二抗体起反应，经过底物显色或荧光成像等方法以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白质。

WesternBlot操作流程

抗原样品的制备

培养的样品需要在裂解液或强去污剂中充分裂解，细胞中的物质(总蛋白、基因、其它内容物等)才能释放出来，随后离心取上清液(即总蛋白混合物)。

常用的裂解成分大多包含Triton X-100、NP-40、十二烷基硫酸钠等，这些成分具有较强的表面活性作用和还原作用，可将细胞膜或核膜裂解，释放其中的物质。

样本处理方法：按需选择

2. SDS-PAGE电泳

裂解后的蛋白质样本经过高速离心去除不溶物后，再经SDS上样缓冲液95-100℃变性5分钟，使带有强负电荷的SDS与带有弱电荷的蛋白质结合，大量的SDS可掩盖蛋白质本身的电荷量，只显示SDS的负电荷，在pH8.6~pH8.8的Tris-甘氨酸不连续SDS-PAGE(聚丙烯酰胺凝胶)系统中，蛋白质的电泳与自身电荷量无关，只和其分子大小有关，从而将蛋白质按分子量大小顺序分离。

凝胶的制备: 根据目的蛋白的大小来选择合适浓度的分离胶。目的蛋白小于20kDa 选择 12%～15%的分离胶；大于20kDa选择10%的分离胶，浓缩胶一般固定为5%。

上样及电泳：加样过程中一定要避免气泡的产生，电泳时间与所调电压有关，一般为上层胶80 V，下层胶120 V，在溴酚蓝指示剂即将跑出胶时结束。

3. 转膜

转膜就是将凝胶中的蛋白，转移到固相支持物上。常用的固相材料有NC膜、DBM、DDT、尼龙膜、PVDF膜等。NC膜全称硝酸纤维素膜，带负电荷的蛋白质可以与膜发生疏水作用而结合到一起，价格便宜，韧性差易碎，但易于封闭非特异性结合。PVDF膜全称聚偏二氟乙烯膜，使用前需用无水甲醇活化(膜表面的正电基团可被无水甲醇活化)，易于吸附蛋白质，价格贵，韧性强，适合小分子量蛋白电转膜。

4. 封闭

为什么要封闭呢？转移成功后的膜上还存在大量的、未吸附蛋白质的小孔，这些小孔就形成非特异性的蛋白质结合位点，为防止这些位点与抗体结合引起非特异的染色和背景，一般用惰性蛋白质或非离子去垢剂封闭膜上的未结合位点来减少抗体的非特异性结合。

5. 抗原-抗体免疫反应

抗体与目标蛋白的特异性结合：首先是一抗与目的蛋白表面的抗原表位结合，然后用二抗与一抗结合，而二抗蛋白结构被HRP辣根过氧化物酶标记，可与发光底物相结合，输出的信号可作为蛋白检测的指标。

6. 蛋白检测

（1）酶促底物DAB显色法

DAB是 HRP（辣根过氧化物酶）的常用底物，在辣根过氧化物酶的催化下，DAB与双氧水反应产生棕色沉淀，该棕色沉淀不溶于水和乙醇，因此在 DAB显色后，还可以使用溶于乙醇的染料进行后续染色。DAB 和 HRP作用形成褐色不溶性产物，灵敏度较弱，且成像性较差，不适合数据展示的需求，现在用的较少。

（2）增强化学发光法（ECL）

ECL 显色原理：在 ECL 底物中，含有 H2O2 和鲁米诺（及其衍生物），在 HRP（辣根过氧化物酶）的作用下，发出荧光。

ECL 与 HRP 作用显色，稳定性好，灵敏度高，成像性好，是目前最常用的显影方法。

WesternBlot应用：

1.从蛋白质混合物中检出目标蛋白质；

2.定性或半定量确定细胞或组织中蛋白质的表达情况；

3.用于蛋白质-蛋白质、蛋白质-DNA、蛋白质-RNA相互作用后续分析。