谈槟榔十三味丸对抑郁模型大鼠海马和前额叶皮层信号通路的影响论

谈槟榔十三味丸对抑郁模型大鼠海马和前额叶皮层信号通路的影响论

蒙医理论认为，“赫依”为抑郁症发病的主要病因。在临床实践中，以槟榔十三味丸(高尤-13)为代表的具有调节“赫依”功效的蒙药在抑郁症治疗中取得了较好疗效。课题组在以往的实验中观察到槟榔十三味丸对小鼠强迫游泳应激模型、利血平拮抗模型以及大鼠慢性应激抑郁模型中均呈现明显的抗抑郁作用。但其分子机制的研究尚未见报道。本研究采用慢性轻度不可预见性应激(CUMS) 结合孤养方法制备大鼠抑郁模型，测定大鼠海马和前额叶皮层腺苷酸环化酶( AC) 活性及环磷酸腺苷(cAMP)、蛋白激酶A( PKA) 含量的变化，旨在从AC-cAMP-PKA 信号通路探讨槟榔十三味丸抗抑郁作用机制。

1 材料

1. 1 动物

清洁级Wistar 雄性大鼠60 只，体重180 ～ 200 g，由斯贝福(北京) 实验动物科学技术有限公司提供，合格证号SCXK( 京)2011-0004。以清洁级大小鼠维持饲料饲养，由北京科澳协力饲料有限公司提供，合格证号京饲审(2009) 06166。动物饲养于北京中医药大学SPF 级动物房，整个实验过程中动物自由摄食和饮水(造模过程中禁食和禁水除外)，室温20 ～ 22 ℃(冷、热刺激除外)，相对湿度为60% ～ 70%，光照周期为12 h，7:00—19:00 光照，19:00—7:00 黑暗(昼夜颠倒刺激除外)。

1. 2 药物

槟榔十三味丸( 国药准字Z15020412，内蒙古蒙药股份有限公司，批号120805);盐酸氟西汀分散片(Patheon France 生产厂，产品批号2076A，分包装厂为礼来苏州制药有限公司，分包装批号2076AA);羧甲基纤维素钠(CMC-Na) ( 国药集团化学试剂有限公司，批号20120330);蔗糖( 北京化工厂，批号20110303)。

1. 3 试剂与仪器

cAMP 放射性同位素免疫试剂盒(北京环亚泰克生物医学技术有限公司，批号2013061121); cAMP ( 美国Rapidbio 公司，批号201305122 ); PKA ( 美国Rapidbio 公司，批号201305173);考马斯亮兰G-250(南京建成生物工程研究所，批号20130514);Kontro-28Dγ 计数仪( 瑞士Kontro 公司);J2-21 低温离心机( 美国Beckman 公司);JY99-ⅢB 型超声器( 宁波新芝科器研究所);5415R 高速离心机(德国Eppendorf 公司);MultiskanMK3 型酶标仪(美国Thermo Scientific 公司);ELx50自动洗板机( 美国Biotek 公司);电子天平( 常熟市双杰测试仪器厂);1 /10 万ES125SM 电子天平( 瑞士precisa 公司);敞箱和电击足底箱(自制)。

2 方法

2. 1 分组和给药Wistar 雄性大鼠适应性喂养1周后禁水24 h，给予1%蔗糖水，测定1 h 内的消耗量，根据蔗糖水消耗量随机分为正常对照组、模型组、氟西汀组(3. 3 mg·kg - 1·d - 1 )、槟榔十三味丸低(0. 25 g·kg - 1·d - 1 )、中(0. 5 g·kg - 1·d - 1 )、高(1 g·kg - 1·d - 1)剂量组，每组10 只。正常对照组大鼠每笼5 只饲养，其他各组孤养。造模同时灌胃给药，正常对照组、模型组灌胃0. 5% CMC-Na，氟西汀组和槟榔十三味丸各组大鼠分别灌胃西药氟西汀、蒙药槟榔十三味丸，各组均按10 mL·kg - 1 体重给药，每周称一次体重，连续给药28 d。

2. 2 制备模型CUMS 结合孤养模型，参照文献[3-5]并略加改进，模型组、氟西汀组、槟榔十三味丸低、中、高剂量组大鼠共接受28 d 各种不同刺激，包括断食24 h，断水24 h，昼夜颠倒24 h，45 ℃热环境5 min，4 ℃ 冰水游泳5 min，夹尾1 min，电击足底(36 V 电压，每隔1 min 刺激1 次，每次持续10 s，共30 次)。

2. 3 RIA 法测AC 活性实验结束后，大鼠断头处死，剥离全脑，在冰盘上迅速分离出双侧海马及前额叶皮层，液氮速冻后- 70 ℃保存待测。将海马和前额叶皮层组织于4 ℃复温，取适量组织样品，按1∶ 40加入预冷的Tris-HCl 缓冲液(0. 05 moL·L - 1，pH7. 4)，在冰浴下充分研磨成组织混悬匀浆液。取适量匀浆液，用Bradford 法测定蛋白含量。反应总体积为500 μL，其中含有50 mmoL Tris-HCl 缓冲液，8 mmoL茶碱，4 mmoL DTT，1 mmoL EGTA，1 mmoL ATP。加入100 μL 组织匀浆后，30 ℃水浴保温15 min，于沸水中加热3 min 终止反应，冷却后于3 000 r·min - 1 离心10 min，取上清液100 μL，Tris-HCl 缓冲液按1∶ 10稀释测定。实验设置空白孔，以反应管的cAMP 量减去空白孔的cAMP 量，即为AC 催化净生成的cAMP量，以pmoL·mg - 1·min - 1表示酶的活性。

2. 4 ELISA 法测cAMP 和PKA 含量取海马和前额叶皮层50 mg 组织样品，加入0. 5 mL 匀浆液(Tris10 mmoL · L - 1，NaCl 137 mmoL · L - 1，KCl 5mmoL·L - 1，CaCl2 2 mmoL·L - 1，MgCl2 2. 5 mmoL·L - 1，蔗糖0. 25 mmoL·L - 1，PMSF 0. 1 mmoL·L - 1，BSA 0. 1%)，液氮中反复冻融3 次，每次10 min，然后在冰浴中超声3 × 4 s，12 000 r·min - 1，离心30min，取上清，用考马斯亮兰G-250 蛋白定量后，采用ELISA 法检测cAMP、PKA 的含量，实验按说明书操作。

2. 5 统计学分析实验结果以珋x ± s 表示，采用SPSS 19. 0 统计软件对原始数据进行统计分析，组间比较采用单因素方差分析法;P < 0. 05 为差异有显著性。

3 结果

3. 1 槟榔十三味丸对大鼠海马和前额叶皮层AC活性的影响与正常对照组比较，模型组大鼠海马、前额叶皮层AC 活性明显降低( P < 0. 01，P<0. 05);与模型组比较，氟西汀组、槟榔十三味丸中、高剂量组大鼠海马AC 活性明显增加( P < 0. 01，P < 0. 05，P < 0. 05)，并且槟榔十三味丸高剂量组大鼠前额叶皮层AC 活性增加尤为显著(P < 0. 05)。

3. 2 槟榔十三味丸对大鼠海马和前额叶皮层cAMP，PKA 含量的影响与正常对照组比较，模型组大鼠海马，前额叶皮层cAMP，PKA 含量明显降低(P < 0. 05，P < 0. 01，P < 0. 01，P < 0. 01);与模型组比较，氟西汀组、槟榔十三味丸中、高剂量组大鼠海马cAMP 含量明显升高( P < 0. 05，P < 0. 05，P<0. 05)，氟西汀组、槟榔十三味丸高剂量组大鼠前额叶皮层cAMP 含量明显升高(P < 0. 01，P < 0. 05)，槟榔十三味丸高剂量组大鼠海马PKA 含量明显升高(P < 0. 05)，氟西汀组、槟榔十三味丸中、高剂量组大鼠前额叶皮层PKA 含量明显升高(P < 0. 05，P < 0. 05，P < 0. 05)。

4 讨论

抑郁症发病机制的信号通路主要有cAMP 通路、钙调蛋白激酶(CaMK) 通路、丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路，其中cAMP 信号通路是研究最早、最为深入的信号通路，它在情绪调节中起重要作用。G 蛋白耦联受体(GPCR) 可与多种神经递质或神经肽结合，其活化导致AC 活性升高，随后通过升高cAMP 水平而激活PKA，活化的PKA 催化亚基最终使CREB Ser 133 磷酸化，调节转录因子活性，从而介导细胞对外界刺激的反应。大量的临床和实验研究表明，抑郁症患者及动物海马、皮层ACcAMP-PKA 信号通路下调。其临床研究发现，有抑郁症史的自杀患者脑组织中鸟苷酸-5'-亚胺二磷酸或forskolin 诱导的AC 活性明显降低，cAMP 含量明显减少。Dwivedi 等进一步证实自杀死亡的抑郁症患者前额叶皮层中cAMP 和PKA 活性均降低，该学者在获得性无助抑郁症模型大鼠中观察到，大鼠脑海马和皮层中的cAMP 和PKA 活性均降低，且大鼠逃避失败的行为改变与之有关。Shelton 等研究抑郁症患者外周血及尸检脑组织标本发现，抑郁症患者PKA 活性降低，在特殊的临床表型尤其是重度抑郁症和自杀患者中，PKA 活性特别低。cAMP信号通路通过神经细胞内PKA 发挥抗抑郁治疗作用。抗抑郁药如洛利普兰能激活AC-cAMPPKA通路，在大鼠和小鼠的多种行为中检测到其抗抑郁的活性。体外实验显示，抗抑郁药物能引起AC 的活性升高，AC-cAMP 通路作用增强，最终引起靶基因或蛋白表达的.改变。

抑郁症属蒙医“赫依”病范畴，其病理机制为诱发疾病的4 个条件即饮食、起居、气候、突发因素等引起“赫依”病变，当“赫依”偏盛、偏衰或紊乱，窜行至心脏阻滞白脉，影响到白脉之海大脑而引起，因此蒙医临床多从“赫依”论治。槟榔十三味丸中槟榔具有调节“赫依”功效，对“赫依”引起的眩晕、心悸等有治疗作用;沉香、紫硇砂、广枣、草乌、木香、当归、葶苈子等具有调节“赫依”、益心、止痛和治气血紊乱之效;酌加的三热药干姜、荜拨、胡椒亦能补益胃火和改善消化;诸药合用共奏调节“赫依”，安神止痛之功。

前期相关研究发现，槟榔十三味丸可明显改善慢性应激抑郁模型大鼠敞箱实验水平运动和垂直运动以及糖水消耗量降低，并抑制慢性应激抑郁模型大鼠HPA 轴功能亢进。海马和额叶皮层是介导应激反应的重要脑区，与行为、认知等神经系统功能密切相关。因此，本实验以海马和前额叶皮层的受体后信号通路作为观察对象，研究槟榔十三味丸对抑郁大鼠不同脑区AC 活性，cAMP 和PKA 含量的影响。结果表明，慢性应激抑郁模型大鼠海马、前额叶皮层等脑区的AC 活性降低，cAMP 和PKA 含量降低，提示慢性应激可能使AC-cAMP-PKA 信号通路下调，本研究结果与文献报道一致。给予氟西汀、槟榔十三味丸(0. 5 或1 g·kg - 1·d - 1 ) 可以拮抗这一作用，使大鼠海马、前额叶皮层AC 活性升高，cAMP 和PKA 含量增加，AC-cAMP-PKA 信号通__路活性增强。而氟西汀组海马PKA 含量和前额叶皮层AC 活性与模型组相比无显著差异，这可能与给药剂量、取标本时间、样本量、检测方法等因素有关。本实验结果也提示，槟榔十三味丸(0. 5 或1 g·kg - 1·d - 1 ) 治疗作用与氟西汀相当，而高剂量槟榔十三味丸(1 g·kg - 1·d - 1 ) 在改善海马PKA 含量和前额叶皮层AC 活性方面作用更显著。由此可见，槟榔十三味丸可能是通过调节受体后ACcAMP-PKA 信号通路而发挥抗抑郁作用。其可能的机制为槟榔十三味丸调节抑郁模型大鼠皮质酮的升高，提高海马、前额叶皮层等脑区5-HT 含量，进而升高5-羟色胺1A 受体(5-HT1AR) 的结合力，促进5-HT1AR 与Gas 蛋白偶联，上调G 蛋白-ACcAMP信号通路功能。Dwivedi 等的研究发现，皮质酮可影响PKA 的催化活性和与[3H]cAMP 的结合并改变大鼠皮质和海马内PKARⅠα，RⅡβ 和Cβ亚基的表达，提示慢性应激可能通过HPA 轴影响PKA 的表达和催化活性。故槟榔十三味丸也可能通过调节抑郁模型大鼠HPA 轴功能而影响PKA活性，进而调节AC-cAMP-PKA 活性。值得提出的是，细胞内信号通路是一个十分复杂的系统，不但受各种外界因素的调控，同时细胞内各信号系统间也存在相互协调作用。因此，槟榔十三味丸对其他信号通路的干预作用如何，这些信号通路间的相互作用和相互联系又如何等值得进一步深入研究。