谈地黄丸类方对肾阳虚大鼠HPA 轴的影响论文
谈地黄丸类方对肾阳虚大鼠HPA 轴的影响论文
地黄丸类方是指以地黄、山药、山茱萸、茯苓、泽泻、牡丹皮等为基础方衍生的一系列用于治疗肾虚的复方，最早出现在汉代张仲景的《金匮要略》中，又名肾气丸，用于治疗肾气不足，气化不及，小便不利的症状，现代多用于治疗肾阳虚证。地黄丸类复方种类较多，应用也较为广泛，尤其以桂附地黄丸、六味地黄丸、知柏地黄丸等应用最多。中医治病的原则是辨证施治，现代疾病虽然复杂，但仍存在明显的证候差异，两类不同复方异病同治的物质基础以及内涵有待进一步研究。目前，肾虚本质的研究主要集中在神经内分泌系统、免疫系统、自由基、衰老等方面。本研究采用经典肾阳虚建模方法氢化可的松注射液肌注2 周造成大鼠肾阳虚模型，观察地黄丸类方对肾阳虚大鼠的生存状态、血浆环磷酸腺苷(cAMP)、环磷酸鸟苷(cGMP)、促肾上腺皮质激素释放激素(CRH)、促肾上腺皮质激素(ACTH)及血清皮质酮(CORT)含量以及cAMP/cGMP 水平的影响，比较3 种地黄丸类方对肾阳虚大鼠生存状态及下丘脑- 垂体- 肾上腺轴(HPA)的影响，为临床合理用药提供依据。
1 材料与方法
1.1 药品及试剂
六味地黄丸、知柏地黄丸、桂附地黄丸，均为河南省宛西制药股份有限公司产品，批号分别为：120309，120301 和120402;氢化可的松注射液，天津金耀氨基酸有限公司，批号：1110211;无菌生理盐水，贵州科伦药业有限公司，批号：20130621;大鼠血浆cAMP 试剂盒， 批号：DRE68730; 大鼠血浆cGMP 试剂盒， 批号：DRE68735; 大鼠血浆CRH 试剂盒， 批号：DRE69547; 大鼠血浆ACTH 试剂盒， 批号：DRE69548; 大鼠血清CORT 试剂盒， 批号：DRE68355，均为广州有田生物科技有限公司产品。
1.2 仪器
LF26-MESJ 分析天平，香港佳立国际有限公司;TC-3K 电子天平，深圳市华恒科技有限公司;欧姆龙体温计MC-246，欧姆龙(大连)有限公司;RT-2100C 酶标仪，深圳雷杜公司。
1.3 动物
SD 大鼠，SPF 级，雄性，体质量180～220 g，广州中医药大学实验动物中心提供，动物合格证号：SCXK(粤)2008-0020。
1.4 分组、模型
复制及给药取SD 大鼠80 只，随机分为正常组10 只，氢化可的松组70 只。正常组肌肉注射等体积生理盐水，其余大鼠每天于后肢外侧肌肉注射氢化可的松注射液25 mg·kg-1，左右后肢交替注射，连续注射14 d。造模结束后，将氢化可的松组的70 只大鼠随机分成7 组(每组10 只)，即模型组，六味地黄丸高、低剂量组(4，1 g·kg-1)，知柏地黄丸高、低剂量组(4，1 g·kg-1)，桂附地黄丸高、低剂量组(4，1 g·kg-1)。灌胃给药，各药物组灌胃相应药物，正常组、模型组给予等体积灭菌蒸馏水，连续21 d。
1.5 一般状态
观察实验期间考察各组大鼠精神状态、体质量、肛温的变化。1.6 血浆cAMP、cGMP、CRH、ACTH 及血清CORT 水平的检测末次给药后1 h，腹腔内注射10 %水合氯醛麻醉大鼠，腹主动脉采血，分装于无肝素钠离心管和有肝素钠离心管中，静止1~2 h，分离血清、血浆，按照试剂盒说明书检测大鼠血浆cAMP、cGMP、CRH、ACTH 及血清CORT 含量;计算cAMP/cGMP。
1.7 统计学处理
方法采用SPSS17.0 统计软件进行分析，各组数据均以均数±标准差(x±s)表示，多组间的比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，组间两两比较用LSD 法。
2 结果
2.1 对肾阳虚型大鼠生存状态的影响与正常组比较，模型组大鼠少动怕冷、大便溏泻、毛发无光泽、消瘦萎靡，3 周后状态基本无改变。与模型组比较，桂附地黄丸组给药2 周后多数大鼠便溏现象好转，行为活跃，精神状态较佳，3 周后基本无便溏现象，动作活跃，毛发有光泽;六味地黄丸组大鼠在给药3 周后便溏现象有所好转，但仍有部分大鼠便溏，大鼠状态趋向良好，动作行为活跃;知柏地黄丸组大鼠给药3 周后除体重略有升高外，其余状态变化较小。给药前除正常组外，其余大鼠采用随机分组，故各组大鼠体质量相似，差异无统计学意义(P > 0.05);与模型组比较，给药2 周，3 种地黄丸方高、低剂量组均能较快的增加大鼠体质量(P<0.05，P < 0.01);给药3 周后，大鼠体质量虽有增长(P < 0.05，P < 0.01)，但增长速率明显降低，最终均未达到正常水平;提示3 种地黄丸方均有纠正大鼠阳虚体质和改善大鼠体质量的作用，且各组无明显差异。
2.2 对大鼠肛温的影响给药前除正常组外，其余大鼠采用随机分组，故各组大鼠肛温相似，差异无统计学意义(P > 0.05);给药2 周，与模型组比较，桂附地黄丸高剂量组能升高大鼠肛温，差异有统计学意义(P<0.05);给药3 周后，桂附地黄丸高、低剂量组仍有升高大鼠肛温的作用，与模型组比较，差异有统计学意义(P<0.05);六味地黄丸高、低剂量组和知柏地黄丸高、低剂量组仍有升高大鼠肛温的作用，但作用不明显，与模型组比较，差异无统计学意义(p>0.05)。提示桂附地黄丸效果可能优于六味地黄丸和知柏地黄丸。
2.3 对肾阳虚大鼠血浆cAMP、cGMP 水平的影响与正常组比较，各组cAMP 含量均无明显变化(P >0.05)，但模型组cGMP 含量升高，且cAMP/cGMP 比值下降(P < 0.01);桂附地黄丸高、低剂量组cGMP含量明显降低、cAMP/ cGMP 比值明显升高，与模型组比较，差异有统计学意义(P < 0.01)，提示桂附地黄丸可能具有温热、助阳的特性，达到调节机体阴阳平衡的作用，而六味地黄丸和知柏地黄丸在调节阴阳方面未表现出显著的作用。
3 讨论
熟地黄主要活性成分为多糖;山药主要活性成分为山药多糖;山茱萸多糖是山茱萸生物学活性物质的重要成分。在3 种地黄丸类方中，六味、桂附、知柏地黄丸均以“三补三泻”为基础方，其中，熟地黄为君药，山药、山茱萸为臣药，共同组成全方的“三补”部分，3 种地黄丸类方均以补为主，通过调节机体免疫达到滋补的功效。
中医阳虚指阳气不足或功能衰退的证候，虚寒为阳虚证最典型的症状。肾精是个体发育的基础，是藏于肾中的精微物质。根据精微物质的阴阳属性可分为肾阴、肾阳，若阴阳平衡遭到破坏，不能自行恢复时，即形成肾阴虚或肾阳虚的病证。本研究采用氢化可的松肌肉注射14 d 成功复制肾阳虚大鼠模型，造模结束后，氢化可的松组大鼠体质量、肛温均有显著降低(P < 0.01)，建模方法可靠。本研究发现，3种地黄丸类方在体质量变化方面均表现出补益的功效，但对于肛温的影响，补阳类方效果明显优于补阴类方，其作用强度表现为桂附地黄丸>六味地黄丸>知柏地黄丸。
国内外对环核苷酸与中医阴阳的关系做了大量的研究报道，美国生物学家Goldberg 在70 年代初曾提出细胞功能调节的阴阳学说，认为cAMP 与cGMP 通常呈拮抗性共同参与细胞反应的调节。国内研究显示，cAMP 和cGMP 在不同疾病虚证患者中的"变化规律，得出相同结论：凡中医辨证阳虚者，cAMP/cGMP 比值明显降低;而各类疾病辨证为阴虚者则表现为cAMP 含量升高，伴以无明显降低的cAMP/cGMP 比值。测定血浆cAMP、cGMP 含量及其比值可以作为帮助判断阴虚、阳虚的一个客观指标，从而可能对临床中病情较为复杂病例的辨证有一定参考价值。研究发现，肾阳虚模型大鼠血浆中的cAMP/cGMP 比值降低。本实验结果显示，桂附地黄丸可显著升高cAMP/cGMP 比值，与模型组比较，差异有统计学意义(P < 0.01)。桂附地黄丸可能具有温热、助阳的特性，达到调节机体阴阳平衡的作用。而六味、知柏地黄丸在调节阴阳方面未表现出显著的作用。
采用氢化可的松可使模型组大鼠垂体前叶的促肾上腺皮质激素(ACTH)的释放受到抑制，形成下丘脑- 垂体- 肾上腺轴(HPA 轴)功能抑制的状态，其症状表现符合中医肾阳虚证的临床表现。本研究采用糖皮质激素注射，造成模型组大鼠HPA 轴功能显著抑制，表明肾阳虚证与神经内分泌系统存在密切联系。桂附地黄丸和六味地黄丸均可显著恢复大鼠HPA 轴功能，其中，桂附地黄丸效果明显优于六味地黄丸，知柏地黄丸无明显改善HPA 轴抑制状态的作用。
本研究对地黄丸类方的药理作用进行研究，主要考察地黄丸类方对肾阳虚大鼠治疗作用的异同。同时发现证型相反的地黄丸类方对肾阳虚大鼠神经内分泌免疫网络的影响既存在差异，亦存在相似的地方。